Aislamiento de cloroplastos

Los cloroplastos, al igual que las mitocondrias, son orgánulos que se originaron como organismos endosimbióticos en la célula eucariota primitiva (teoría endosimbiótica). Luego, contienen estructuras genéticas propias, incluyendo el ADN.

Presentan una doble membrana externa y un tercero sistema de membranas en su interior, las membranas del tilacoide.



Fotografía de Xanthidium armatum de Proyecto Agua en Flickr

En el cloroplasto ocurre un proceso endotérmico: la utilización de la energía de la luz para fabricar hidratos de carbono que conocemos como fotosíntese, y que con fines didácticos se divide arbitrariamente en dos grupos de reacciones denominadas reacciones fotodependentes (fase luminosa), que ocurre en los tilacoides y en las que se absorbe energía luminosa por parte de la clorofila y otros pigmentos, conservándola en forma de energía química en la molécula de ATP y poder reductor en forma de NADPH y reacciones fotoindependentes (fase oscura), en la que a partir de la energía y poder reductor formado previamente se reduce lo CON El2 a glucosa. El ATP y NADPH producidos durante la fotosíntese también pueden ser utilizados para la síntesis de otros compuestos orgánicos.

Una célula vexetal típica contiene diferentes tipos de orgánulos y moléculas, luego el estudio de la función o de las características de un componente específico debe normalmente comenzar por un proceso de purificación.

El primer paso es normalmente la lisis, o la ruptura traumática, de las células pero siendo lo suficientemente suaves como para liberar el orgánulo o molécula deseada intacta. Esto pode hacerse mecánica, quimicamente o usando agentes biológicos.

La lisis celular se hace normalmente en la presencia de un tampón biológico de apropiado potencial osmótico y pH, a menudo se añaden inhibidores de proteasas y el procedimiento general se realiza la temperaturas bajas (aprox. 4 ºC) con el propósito de demorar la degradación de los componentes celulares. El aislamiento de los cloroplastos se lleva a cabo en condiciones de luz débil para minimizar la fotodestrucción de la clorofila.

Una vez lisadas las células vegetales hace falta separar los componentes celulares o moleculares que se precise. Existen diversidade de técnicas que permiten la separación: centrifugación, diálisis, decantación, cromatografía y electroforesis. Normalmente se utiliza una combinación de varios disteis métodos para retirar el material no deseado.




Fotografía en Flickr de http://www.flickr.com/photos/medupe89/


Método:

Previamente:

1.Material de vidrio que se vaya a utilizar debe de estar frío (mantener en cama de hielo picado) y los reactivos deben de conservarse en cámara fría (4 ºC).

2.Preparar un baño de agua caliente.

3.Lavar las hojas de espinaca con agua de la llave. Aclarar la conciencia en agua destilada, la lo menos dos veces. Secar suave y totalmente al aire sobre papel de filtro.

4.Seleccionar varias hojas y retirar partes dañadas se las hubiera.

5.Pesar 10 g del tejido vegetal seleccionado eliminando previamente los nervios centrales.

6.Corta el tejido muerto como sea posible. Colocar en el interior del morteiro frío conteniendo 25 mL de solución de extracción y aplastar con nitrógeno líquido hasta formar una pasta fina.

A partir de ahora realizar todas las operaciones sobre una bandeja con hielo picado.

1.Filtra la solución sobre uno matraz Erlenmeier de 100 mL a través de un embudo con 4 capas de gasa y presiona a pulpa vexetal para recuperar toda la solución de extracción.

2.Reparte la suspensión verde en dos tubos de centrífuga que contengan exactamente la misma cantidad de solución1. Colocarlos enfrentados en la centrífuga y centrifuga durante 2 minutos a 1500 rpm para aglomerar las células y fragmentos celulares.

3.Decantar el sobrenadante en nuevos tubos de centrífuga y recentrifugar esta solución a 2600 rpm durante 7 minutos. El aglomerado formado durante esta centrifugación contiene los cloroplastos. Decanta y rechaza el sobrenadante.

4.Resuspender el aglomerado con los cloroplastos en 5 mL de solución de suspensión fría. Si fuera necesario utiliza coidadosamente una varilla de vidrio para desorganizar el aglomerado.

5.Cubrir el tubo con una lámina de papel de aluminio y mantener en frío.

6.Recoger 2 mL de la suspensión obtenida en un tubo de ensayo y al baño maría llevarlo a ebullición (mantener el resto de la solución en oscuridad y frío). Enfriar el tubo fervido rapidamente dentro de un vaso con agua fría. Los cloroplastos hervidos permanecen inactivos.
Determinación de la concentración de clorofila

7.Pipetear 5 mL de acetona al 80% en un tubo de ensayo y añadir 0.5 mL de la solución de cloroplastos ser ferver, agitar y dejar reposar 5 mí.

Medir la absorbancia de la solución a 465 y 663 nm.

8.Anotar los resultados en la siguiente tabla.

Longitud de onda
Absorbancia
465 nm
1,201

663 nm
0,997

9.Calcular la concentración de clorofila en la suspensión de cloroplastos de acuerdo con la fórmula:

clorofila (ug/mL) = 20.2 x Abs465 8.02 x Abs663 =
clorofila (ug/mL) = 20,2 x 1,201 8,02 x 0,997 = 32,256 ug/mL

10.Del tubo no fervido recoger, con una pipeta pasteur, unas gotas de solución y colocarlas en un puerta de microscopio, cubrir con un portaobjetos y comprobar al microscopio el estado de la solución.

11.Guardar los tubos obtenidos en oscuridad y frío (4 ºC) para realización de la siguiente práctica.